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一、文章來源

文章下載鏈接:/uploads/tmp/genedenovo-resume-1413439133.1232745.pdf

荔枝退化葉的轉錄組組裝及活性氧脅迫導致的差異表達基因的找尋。周碧燕,華南農業大學。

二、背景

爲了找到應對措施,了解荔枝花蕾發育背後的遺傳學信息非常重要。
用Illumina RNA-seq构建了一个荔枝早期叶的参考转录组,为了弄清活性氧诱导的与叶衰老、脱落相关基因网络,用数字基因表达谱分析活性氧处理的早期叶转录组动态分析图谱。

背景:荔枝书属热带、亚热带广泛种植的常绿木本树。在全球变暖、气候变化时导致的开花缺陷对于荔枝生产是主要挑战。以前的研究已经表明,高温条件可促进花蕾中早期叶的生长并且抑制荔枝开花,而甲基紫精二氯化物(MV)诱导的活性氧可以促进早期叶的衰老、脱落。为了解活性氧在荔枝开花过程中的分子功能,对荔枝进行了轉錄組測序并从头进行组装。

三、結果:
组装得到 82036 unigenes,58%(47596)在Nr数据库中能找到高度相关的注释。
5223 unigenes 被发现在活性氧处理组与非处理组的早期叶中差异表达,并且与植物激素信号组分(如脱落酸和乙烯)相关的编码基因显著富集。

四、材料與方法

1. 材料与处理

生长于华南农业大学实验果园,13年树龄的荔枝经济种植品种。将新长出的约6cm长的树枝切下并立即放入水中。两小时后,将树枝用40μM的MV溶液处理。所有树枝放入20 ℃、160μmol/m2s1光量子通量密度的培养室中。

如圖1A中第3和第4處的早期葉MV處理0小時,5小時,10小時後,進行取樣,在液氮中冷凍並儲存在-80℃用于RNA測序和定量qRT-PCR。
 

前期研究發現,早期葉衰老脫落的前期特征是出現向下生長的葉子。爲證實MV的處理效果,將樹枝用MV處理後,測量了3與4處的近端角α和遠端角β。處理後近側角α(如圖1A)沒有顯著變化,而遠端角β在處理後顯著增大(表1)。這說明活性氧處理後能顯示出早期葉衰老和脫落(圖1B,C,D)的早期征兆。

2. 测序、De novo组装与注释

2.1 转录组组装结果

6-10個樹枝混合葉作爲一個樣本,在0h、5h、10h每個樣本兩個重複。

爲了得到荔枝早期葉的參考轉錄組,將6個測序的樣本數據組裝到一起

2.2 转录组注释结果

A:4個常用的蛋白數據庫的注釋結果
B:Nr數據庫的注釋情況
C:被注釋到的unigenes物種情況

28,556 unigenes 大部分在4个物种中找到注释, 包括
Glycine max(大豆), Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula(苜蓿) 和Populus trichocarpa(毛果杨)

Unigenes的GO注釋

23,278 unigenes 能够被GO数据库分成3类

Unigenes的KEGG注釋


荔枝早期葉的13728個unigenes能夠比對到KEGG的274條代謝通路中

6個DGE文庫中reads覆蓋度統計

不同的Reads覆蓋種類的分布在6個文庫中有相似的形式

重複實驗可靠性驗證
顯示其方法上有很好的重複性

3. 基因的差异表达注释

以0h作爲對照組,5h、10h作爲處理組。
差异表达基因筛选条件: unigenes 符合 FDR ≤ 0.001 且 log2 Ratio ≥ 1
5223個unigenes被選出,認爲有差異表達,並用來進行後續分析。

3.1 差异表达基因的GO分析

为查看5223个DEGs的表达趋势, 0h到10h的活性氧处理表达量数据归一化为0, log2 (υ5h/υ0h), log2 (υ10h/υ0h). 用STEM 软件将所有 DEGs 趋势分为8类。

显著DEGs(A-D) 的GO 分类

3.2 差异表达基因的KEGG富集分析

 28.6% (1,494/5,223) 的DEGs 能够被注释.
DEGs注釋到的最有代表性的前10個KEGG代謝途徑于表4中列出

植物激素信號轉導
(ko04075),
澱粉和糖代謝(ko00500),
細胞周期(ko04110),
嘧啶代謝
(ko00240),
嘌呤代謝(ko00230),
植物病原相互作用(ko04626) 和
內質網途徑的蛋白加工(ko04141).

3.3 与活性氧反应信号转导通路相关差异表达基因分析

3.4 KEGG中与植物激素信号传导通路相关的差异表达基因的表达量热图绘制

基因表達量數據被歸一化爲Z值

4. qRT-PCR验证差异表达基因

确认的转录组分析结果的准确性和再现性, 7个Unigenes被选定为实时定量逆转录聚合酶链反应(定量RT -PCR )验证

4.1 差异表达基因的qRT-PCR与RNA-seq的表达比较

通过qRT-PCR (左侧)和RNA-seq(右侧)显示候选的Unigene表达水平。定量qRT-PCR檢測的數據是3個重複,RNA-seq的RPKM是兩個重複的結果。

4.2 定量RT -PCR和RNA-seq之间的倍数变化的数据系数分析。

基因表達比率的倍數變化線性回歸分析
RNA-seq 与 qRT-PCR显示显著正相关(图 6),证实了我们的转录组分析.

7个Unigenes被选定为定量RT - PCR检测。通过从RNA-seq( x轴)和定量RT-PCR ( y轴)的log2表达比生成散点图。

5.結論

1.我們的轉錄組數據可作爲全面收集的荔枝葉片表達序列標簽(ESTs),這是未來對荔枝等密切相關的物種的基因組學研究的重要資源。
2.已確定的差異表達基因還可提供潛在候選基因,用于圓錐花序的早期葉對照下,與荔枝開花過程相關的基因功能分析。

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