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文章總體分析路線,如下圖:


這篇文章的巧妙嚴謹之處在于:

1. 这篇文章是研究赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)对花瓣发育互为相反的作用机制的,作者是怎么选材和设置激素处理时间点的呢?

首先作者每天用GA或ABA噴塗花絮一次,9日後收樣,並測量花瓣長度。
結果顯示GA顯著促進了花瓣的延長,而ABA處理的花瓣比正常對照顯著縮短,說明這兩種激素在調控花的發育(大小)方面起著相反的作用。



然後作者用以上的方法同樣處理離體的花瓣,並測量頂部、中部和基部三個部位的花瓣長度和細胞長度,結果顯示GA處理組的三個部位的細胞長度都顯著增長,而ABA處理組的細胞長度只在基部明顯縮短。這些結果說明了花瓣延長與細胞延長有關,並且GA和ABA的相反作用只局限于基部位置。


然后作者用一种激素处理花瓣2h, 12h, 24h后,加入另一种激素,来研究GA和ABA的联合作用。发现这两种激素都能减弱对方的作用,并且ABA只在GA处理2h后显著减弱GA的增长效果,而GA在ABA处理2h和12h后都显著增长了花瓣长度,说明GA和ABA的效应是相反的,并且这些效应在12h后就不再显著。


基于這些結果,因此作者選擇了激素處理2h和12h後的花瓣基部,來做RNA測序。


2. 找出差异表达基因后,作者是怎样挖掘出与GA和ABA促进和抑制作用相关的关键通路和基因呢?

因为GA和ABA这两种激素对非洲菊花瓣发育的作用是相反的,因此作者把差异基因(DEGs)分成三类,第Ⅰ类是GA或ABA处理2h比上正常对照(con vs GA2h, con vs ABA2h ),第Ⅱ类是GA或ABA处理12h比上处理2h(GA2h vs GA12h, ABA2h vs ABA12h),第Ⅲ类是GA或ABA处理12h比上正常对照(con vs GA12h, con vs ABA12h )。并统计了这三类DEGs在GA和ABA中表达模式相反的基因数目(GA-up, ABA-down,或GA-down, ABA-up)。


隨後的GO功能富集分析也是按照這三大類DEGs來分別分析的:
在第Ⅲ类DEGs(12h)中,差异基因显著富集于“cell wall organization”这个GO条目中,特别是子类“cell wall loosening”,这些编码扩展蛋白的差异基因被GA激活,但被ABA抑制,而扩展蛋白被认为是细胞延长的分子标记。

在第Ⅱ類DEGs(12h/2h)中,差異基因富集于“凋亡”這個GO條目中,並且在GA中上調,在ABA中下調。這些基因編碼了一組病原相關抗病蛋白,雖然GA和ABA可調節病原體引起的植物免疫應答,然而凋亡在GA/ABA調控的花瓣發育中到底起什麽作用還需要更進一步的研究。

在第Ⅰ類DEGs(2h)中,差異基因顯著富集于“轉錄調控”這個GO條目中,並且在GA中下調,在ABA中上調。這些差異基因包括了9個轉錄因子(TF)。

結合已有的報道和現有的數據,作者得出這些轉錄調控因子在非洲菊花瓣的細胞生長方面起著重要作用,GA處理後,TF被抑制,因此被TF抑制的與細胞壁松散、凋亡相關的基因得到表達,細胞得到延長;相反,ABA激活了TF,從而抑制了細胞延長。

然后,KEGG富集结果也不出意外的显示,差异表达基因在所有样本中都显著富集于植物激素信号通路(plant hormone signal transduction)。另外,多种激素相关信号通路也显著富集,如与赤霉素生物合成和代谢相关的双萜类生物合成通路(diterpenoid biosynthesis pathway)、与ABA生物合成和代谢相关的类胡萝卜素生物合成通路(carotenoid biosynthesis pathway),这与之前报道的非洲菊花瓣发育与一系列相互联系的激素信号通路有关的结论一致。

然後,作者將參與了GA和ABA合成、代謝和信號通路的DEGs作熱圖聚類分析,結果顯示GA或ABA處理2h後,大部分DEGs顯示出相反的表達模式,但處理12h後表達模式類似,表明了激素相關信號通路的轉錄調控在花發育過程中是早期的短暫的(下圖D-G)。


小結

這篇文章是典型的植物發育轉錄調控分析的文章,有兩點值得我們借鑒:
1. 实验设计与取材。作者通过一系列的预实验,证明了GA和ABA对花瓣发育起相反作用的位置是花瓣基部,并且在2h和12h比较显著。
2.如何從一大堆差異表達基因裏面找出與研究相關的關鍵基因。就是要回歸生物學意義,根據樣本的特點,對差異基因進行分組分類。比如本文根據GA和ABA對花瓣發育的相反作用,把在GA和ABA處理組中呈相反表達趨勢的基因分爲一類,這樣就使邏輯變得清晰,問題變得簡單,並且更貼近于研究目的。

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