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蘋果小RNA文獻解讀

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研究背景與目的
在黄土高原地区,绿苹果(Granny Smith)在成熟期摘袋复照后会变红,已有研究证明苹果皮中一些miRNA的表达受不同光照条件的影响。而苹果着色度是苹果品质的重要指标之一。为此,研究人人员发现并分析了果皮中miRNA在摘袋后复照过程中所起的作用。

目的:通过检测Granny Smith的小RNA找出导致摘袋复照后果皮变红的miRNA。


研究樣品
西北农林科技大白水苹果研究所,6个Granny Smith混合苹果皮样本:
實驗組:落花後第10d/40d套袋,于第120d/160d摘袋,摘袋後重新暴露于自然光照中,分別于摘袋後0h,6h,1d采摘。
對照組:未套袋和實驗組來自同一顆果樹,在自然光照下成熟並在相同時間采摘。(每組均爲來自10棵蘋果樹的20顆蘋果皮混樣)

文章脈絡

1、測序結果
    •建立了6个Granny Smith苹果皮sRNA数据库T1\T2\T3\N1\N2\N3
    •47%比对到苹果基因组,miRNA约占sRNA总数的8.5%,且长度分布合理。

2、miRNA的鑒定
    •分属43个苹果miRNA家族的201条miRNA序列被检测到。
    •其中miR156、miR171、miR172家族所占比例最多。
    •已有研究证明在苹果树中大量积累的MIR477、MIR482、MIR3627在苹果皮中也发现被大量积累。
    •比对苹果基因组参考序列、non-coding rRNAs、tRNAs、snRNAs、snoRNAs、miRBase后得到220个新miRNA。

3.1、差異表達miRNA分析(組間)
套袋和不套袋組間比較後
•共發現屬于54個miRNA家族的126個miRNA差異表達。
•说明:套袋前后,Granny Smith苹果皮中部分miRNA差异表达。

3.1、差異表達miRNA分析(組內)
套袋後不同複照時長組比較後
•發現T1、T2組中有24個miRNA差異表達。
•上述結果說明,套袋後光照時間長短會影響蘋果皮中部分miRNA的表達水平,不同光照條件可以調節一些miRNA的表達。
•那麽這些miRNA作用于哪些靶基因?這些靶基因又是否對蘋果皮變紅有影響呢?研究人員又進行了靶基因預測和功能通路富集分析。


3.2、差異表達miRNA的靶基因預測
•從已知miRNA中獲得1334個目標mRNA,從新miRNA中獲得1055個目標mRNA。
•篩選出套袋和未套袋組間差異表達的miRNA靶基因進行GO、KEGG富集分析,對靶基因功能進行預測。

•通過GO功能富集分析,發現差異表達的關鍵miRNA的靶基因功能多存在于花青素合成代謝等細胞進程、代謝進行和刺激應答過程。
如miR156:靶基因爲轉錄因子MdSPL,受紫外線輻射調解;
miR828:靶基因为转录因子MdbHLH ,参与花青素合成代谢调控
miR858:靶基因爲轉錄因子MdMYB9,參與花青素合成代謝調控; 
•通过KEGG通路富集分析,发现关键miRNA的靶基因都属于苹果皮的抗氧化通路, 类黄酮生物合成,花生四烯酸代谢,谷胱甘肽过氧物酶代谢等。其中类黄酮生物合成已被证明对植物抗UV辐射起关键作用。
•靶基因功能分析说明,摘袋后果皮变色是Granny Smith为了应对环境压力的一种光保护作用,而花青素的累积增多,就是最显著的表现。

4、 qRT-PCR验证

•試驗中套袋組果皮中花青素含量極低,摘袋後均上升。
•qRT-PCR检测miRNA和对应的靶基因表达量发现3种miRNA:miR156、 miR828、miR858共同作用调控GrannySmith中花青素合成积累。


研究結果
•发现已知miRNA201个,novel miRNA220个。
•套袋和未套袋果皮中存在差異表達的miRNA,且它們的靶基因多參與調控花青素合成代謝。
•找出3种与Granny Smith果皮中花青素合成代谢相关的miRNA: mi156、miR828、miR858

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