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乳腺間質成纖維細胞在患乳腺炎奶牛中表現出的炎症特異性變化

合作老師:西北农林科技大学 高明清

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研究背景
•纤维细胞( Fibroblasts)是乳腺基质细胞主要的组成部分,已被证明有免疫调节作用,在乳腺的生长发育过程中是关键的结构部件,在伤口愈合和机体清除病原微生物的过程中,成纤维细胞被感染过程中创伤组织释放的一些物质激活,从而发挥哨兵细胞(sentinel cells)的作用。
•乳腺炎是一種由微生物感染引起的炎症反應,牛乳腺炎被認爲是奶牛中“最貴”的傳染病,對養殖業和相關乳制品行業均産生極大威脅。
•乳腺炎的發生是否使乳腺間質成纖維細胞産生炎症特異性變化,尚未被證明。

研究目的
•比較患乳腺炎組(INFs)和未患乳腺炎組(NFs)奶牛乳腺纖維細胞在細胞形態、增殖、死亡、遷移過程中的差異;
•構建INFs和NFs乳腺纖維細胞兩個轉錄組數據庫,比較全基因組表達譜差異,進一步研究乳腺間質成纖維細胞在乳腺炎中發生的變化。
•通過體外共培養模型研究炎症相關纖維細胞産生的變化及對正常上皮細胞的作用。

奶牛乳腺纖維細胞轉錄組研究思路

一、基礎研究
1.發現差異
在前期基礎研究中,作者通過健康膛#∟Fs)與患乳腺炎奶牛(INFs)乳腺組織切片\HE染色切片發現NFs組與INFs組存在差異。

2.能否與其它細胞區分?

健康膛#∟Fs)與患乳腺炎奶牛(INFs)

發現了兩組乳腺的差別,那麽乳腺中的纖維細胞能否和其它細胞區分開呢?試驗結果證明,切片或間接免疫熒光試驗能明顯區分鑒別上皮細胞與INFs細胞和NFs細胞,爲後續試驗分離樣品做好准備。

二、NFs與INFs差異比較

通过健康膛#∟Fs)與患乳腺炎奶牛(INFs)电镜图发现, INFs组与NFs组织形态相似,但包含更多溶酶体空泡。除此之外,二者之间还有哪些差异
爲研究乳腺炎能否增強乳腺間質成纖維細胞的增殖,作者對NFs和INFs進行體外培養數天後分別檢測其增殖情況,發現INFs的增殖速度顯著高于NFs(Fig.B),但二者細胞凋亡比率一致(Fig.C)。

      

两种肌成纤维蛋白的标志蛋白FAP蛋白(fibroblast activation protein) 和α-SMA 蛋白(alpha-smooth muscle actin )在INFs组表达量明显增加。(Fig. D)

两种炎性细胞因子IL-6和TNF-α都被检测到在INFs细胞中表达量升高。(Fig. E)

上述結果說明,相比健康膛T诨既橄傺椎奶牛乳腺中,乳腺間質成纖維細胞會有明顯變化。並且能夠通過電鏡切片、增殖情況、凋亡情況區分NFs和INFs細胞。

三、轉錄組研究
成功分離INFs和NFs後,作者對它們進行了轉錄組研究。

1.1測序組裝結果統計

未患病組NFs:獲得12,167,245條reads,670條unigenes
患乳腺炎组INFs:获得12,165,544条reads,763 条unigenes
NFs與INFs共表達基因:12841條

並統計了差異表達基因中,相比NFs組,INFs組上調(372)和下調(355)的基因。

1.2 Unigene的GO功能分析
GO功能富集分析發現DEGs在3大類別,包括細胞外基質、組織形成、調節發育代謝過程等10個功能上顯著富集。

1.3 Unigene的KEGG代谢通路結果分析
通過Pathway分析將618個DEGs注釋到228條代謝通路,以Qvalue<0.05過濾出14條顯著富集的代謝通路。

隨後在富集結果基礎上做出富集因子散點圖(注釋到該通路上的DEGs數量與注釋到其上的所有基因數量之比即爲富集因子值)。

發現Unigene多存在于細胞融合粘附、免疫應答和生物合成與代謝三條主要通路。

1.4 DEGs深入分析

                                  

基于GO分析和KEGG pathway分析,作者选出细胞外基质重构、细胞融合粘附和免疫应答三方面的DEGs,对它们进行深入分析。A.纤维细胞在组织分化形成过程中,主要负责细胞外基质(ECM)的合成重构,可作为炎症反应的“哨兵细胞”。对20个ECM重构相关DEGs进行热图聚类分析。結果显示,相比NFs组,INFs组中LAMA2,LAMC2,ITGBL1,ITGA9基因均显著上调表达;COL4A1基因下调表达。

基于GO分析和KEGG pathway分析,作者选出细胞外基质重构、细胞融合粘附和免疫应答三方面的DEGs,对它们进行深入分析。B. 对42个细胞融合粘附相关DEGs进行热图聚类分析。結果显示,相比NFs组,INFs组中FER1L6,TUBB4A,AHNAK2,Fbp20基因均显著上调表达;GUCY1B3,PLCB4,PRKCQ,MYH6,CLDN1基因下调表达。

基于GO分析和KEGG pathway分析,作者选出细胞外基质重构、细胞融合粘附和免疫应答三方面的DEGs,对它们进行深入分析。C.免疫应答相关的39个DEGs大部分属于参与炎症反应的生长因子、细胞因子、趋化因子或其相应的受体,例如CXCL12,C-C motif,CCL5 ,CFB,FAS等。

上述結果進一步說明,乳腺炎的發生,會誘導奶牛乳腺間質纖維細胞産生炎症特異性的改變。

四、RT-PCR驗證
1.5 RT-PCR验证RNA-seq
爲檢驗RNA-seq結果准確性,作者隨機挑選19個DEGs進行RT-PCR驗證實驗。結果顯示與RNA-seq一致。

五、INFs功能驗證試驗
胸腺上皮細胞是乳腺最主要的細胞成分,作者爲了進一步驗證患乳腺炎奶牛乳腺中分離的纖維細胞是否會對上皮細胞的功能特性産生影響,將健康膛H橄僦刑崛〉上皮細胞分別與INFs和NFs細胞進行體外共培養。結果顯示:

在間接共培養模型中,相比NFs組,INFs能夠顯著抑制上皮細胞的增殖。

在以NFs或INFs爲培養基的情況下,上皮細胞凋亡率一致。

在上皮細胞間接共培養模型中,相比NFs組,INFs能夠顯著抑制β-casein蛋白的表達。(Fig.C)

在上皮細胞間接共培養模型中,相比NFs組,INFs能夠在mRNA水平和蛋白水平上調TNF-α和IL-8的表達,但不影響IL-6的表達。(Fig.D)

INFs功能實驗證明,INFs細胞對乳腺上皮細胞的生物學特性及功能均能産生影響。

結果
1. 从患乳腺炎奶牛乳腺中提取到的乳腺间质纤维细胞会产生炎症特异性变化,是重要的炎症细胞并参与疾病进程;
2. 纤维细胞产生的炎症特异性变化包括:溶酶体空泡增加、增殖能力增强、上调炎性相关基因、显著的抑制了上皮细胞的增殖和β酪蛋白的分泌,并且上调上皮细胞中的细胞因子TNF-α 和 IL8。
3. 纤维细胞可以作为治疗乳腺炎的靶细胞进行更深入的研究。

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