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玉米轉錄因子導入擬南芥研究镉離子脅迫耐受機制

合作老師:华南植物园 贺立龙

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基迪奥新文章,研究玉米转录因子在拟南芥镉离子胁迫耐受中的调控机制。发表在Plant Physiology杂志上,IF 6.84。

研究背景

镉離子是土壤重金屬汙染的其中一種,會影響植物生長,並且長期慢性攝入镉離子會造成很多健康問題,如癌症、心血管疾病等。因此,研究農作物對镉離子脅迫的耐受機制,有助于我們進行作物改良。
之前有报道指出,氧化应激蛋白(oxidative stress 2,OXS2)在拟南芥压力应激和压力逃避方面发挥重要作用。其中,在压力逃避方面,OXS2通过激活下游一些开花基因如SOC1,从而促进植物繁殖、保证植物生存。但OXS2是如何激活压力耐受信号通路却不清楚。
由于本文作者主要是想研究玉米這種經濟作物,因此選擇轉基因的方法,在模式生物擬南芥中研究與鑒定OXS2激活下遊信號通路的靶基因。

文章總體研究思路

研究結果
1. Blast比对预测拟南芥OXS2基因在玉米中的两个同源基因
結果:找到了兩個同源基因:ZmOXS2b和ZmO2L1,並且這兩個基因在镉離子處理下的玉米中表達量上調了2-3倍,說明這兩個同源基因可響應镉離子脅迫。

2. 将玉米同源基因导入拟南芥中,并检测其对镉离子的耐受性
將ZmOXS2b和ZmO2L1轉基因導入野生型擬南芥和oxs2-1、o2l1-1突變體中,並檢測四株轉基因擬南芥對镉離子的耐受性。結果發現,導入玉米同源基因後,擬南芥對高濃度镉離子的耐受性增強,與非轉基因植株相比,根生長更長、嫩芽生長更快。

                                 

3. RNA-seq检测差异表达基因
然後利用RNA-seq,檢測轉基因擬南芥和非轉基因擬南芥在镉離子脅迫下基因表達的差異變化。差異表達分析結果顯示,共有30個差異表達基因在ZmOXS2b與ZmO2L1轉基因植株共有(維恩圖交集部分),這些基因在兩種轉基因植株中表達模式相似(圖B)。其中14個基因與應激、金屬離子運輸相關。


備注:作者給這30個DEG從1-30命名了。

4. qPCR验证RNA-seq结果
对这30个共有DEG进行qPCR验证,其中8个DEG与非转基因植株相比,基因表达量变化最大(3.6~13.9倍)(上图 C)。这8个DEG甚至在没有镉处理的情况下也会在转基因植株中表达上调。
這8個DEG分別是:DEG7,DEG11,DEG19,DEG20,DEG21,DEG23,DEG24,DEG30

5. 体内体外实验验证ZmOXS2b和ZmO2L1激活DEG启动子上的转录因子结合位点BOXS2 motif

得到了轉入玉米基因後表達量上調的基因後,那麽下一步就要研究這兩個玉米OXS2基因是怎樣與擬南芥的靶向基因相互作用的。之前有報道指出,AtOXS2可通過結合一段富含CT的9bp長的motif來激活啓動子,這段motif稱爲BOXS2。那麽,我們可以猜測,玉米OXS2基因可能也是通過轉錄因子結合的方法,激活下遊靶向基因的表達的。因此,對上一步得到的8個DEG進行轉錄因子結合位點計算機預測,發現DEG11,DEG21,DEG23的啓動子區都含有潛在的BOXS2轉錄因子結合序列。然后作者通过体外荧光素酶报告基因实验和体内ChIP-qPCR实验,来验证计算机预测的结果,验证ZmOXS2b和ZmO2L1是否是通过结合BOXS2 motif来激活启动子的。

體外熒光素酶報告基因實驗:將8個DEG的啓動子與熒光素酶報告基因融合(圖A)

體內ChIP-qPCR實驗:擬南芥中導入含有FLAG標簽的ZmOXS2b和ZmO2L1,然後用FLAG抗體共沈澱,並qPCR驗證DNA表達量(圖B)

結果:体外实验和体内实验的结果都发现,只有这三个含有BOXS2  motif的DEG的结果为阳性,说明ZmOXS2b和ZmO2L1是通过转录因子的方式,结合BOXS2元件,从而激活下游靶向基因的启动子。这结果也说明实验验证的结果与计算机预测的结果高度一致。

6. 过表达8个DEG检验能否增强拟南芥对镉离子的耐受性
然後作者構建了這8個DEG的過表達載體,轉入擬南芥中過表達這些基因,發現只有DEG23能夠增強擬南芥對镉離子的耐受性,並且只過表達DEG23已經能夠增強擬南芥對镉離子的耐受性了,說明這個基因在緩解镉離子毒性中起著很重要的作用。
DEG23編碼一個甲基化轉移酶,因此被命名爲CIMT1。(在CIMT1過表達系,CIMT1表達量上調了14-17倍) 

7.驗證ZmOXS2b和ZmO2L1確實是通過結合BOXS2序列來激活CIMT1啓動子的
秉着严谨的科学态度,作者又在目标基因CIMT1启动子上设计了四对引物(如下图), 进行ChIP-qPCR来检验ZmOXS2b和ZmO2L1是否通过结合BOXS2序列来激活CIMT1启动子。

結果:
只有包含了BOXS2 motif(图中黑色部分)的F12和F20引物对的ChIP-qPCR结果是阳性的,说明ZmOXS2b和ZmO2L1确实是通过结合BOXS2序列来激活启动子,并且这种作用并不依赖于镉离子(也做了不加镉的处理,结果同样是阳性)。

總結:
其实这两个玉米氧化应激蛋白,就是转录因子,文章通过将这两个同源基因导入拟南芥,在模式生物中研究这两个转录因子的下游靶向基因,通过计算机预测、体内体外实验,逐步缩小范围,最终找到了一个靶标基因CIMT1,这个基因启动子上的BOXS2 motif可以结合玉米转录因子,从而被激活表达,缓解镉离子对植株的毒性。

展望:
其實玉米才是這個實驗室的目標研究作物。這篇文章找到擬南芥CIMT1基因後,作者展望了可以通過找出CIMT1在玉米中的同源基因,然後研究這個同源基因能否在玉米镉離子脅迫中也發揮相似的作用。

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