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蓖麻胚乳型種子基因組DNA甲基化

合作老師:昆明植物所  徐伟教授

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本文的研究目的是了解甲基化對印記基因的影響。但在實際研究過程中,解釋完研究問題後,卻發現了TE上存在著“奇怪”的甲基化現象。

總體分析思路

蓖麻籽胚和胚乳的DNA甲基化圖譜比較

研究目的
揭示蓖麻種子基因組甲基化模式
研究蓖麻種子DNA甲基化與基因表達的關系
解釋蓖麻胚乳特有CHH甲基化模式的形成機制

實驗思路

測序路線

背景資料—植物甲基化類型及相應甲基化相關酶
植物甲基化類型:CG,CHG,CHH
植物甲基化相關酶分類表

1.參與甲基化的基因鑒定及組織特異性表達分析
實驗方法
以擬南芥爲參考,通過氨基酸系列及結構域分析,找出蓖麻種子中與甲基化相關的基因(甲基化酶和去甲基化酶)。
然後利用qRT-PCR分析這些甲基化相關基因在根,莖,葉,胚,胚乳等多個組織的表達情況。

實驗結果
通过生物信息学分析发现蓖麻的8个甲基化酶:RcMET1-1,RcMET1-2,RcCMT1,RcCMT2,RcDRM1,RcDRM2,RcDRM3,RcDnmt2,和3个去甲基化酶:RcDME, RcROS1和RcDML3。
qPT-PCR結果顯示這些甲基化關聯酶在胚和胚乳不同發育階段的表達模式不一樣,這預示著在種子的不同發育時期,胚和胚乳的甲基化水平有可能成動態變化。

組織特異表達甲基化基因


各甲基化關聯基因在蓖麻不同組織的表達情況
圖中縱坐標表示基因表達量,橫坐標表示不同植物組織(以不同顔色表示)。

2. BS测序鉴定蓖麻特有甲基化模式
實驗方法
收集35DAF蓖麻種子,分別對胚和胚乳進行BS測序。
然後通過對比其他物種的甲基化模式分析蓖麻特有甲基化模式。
分析蓖麻自身CG,CHG,CHH三種甲基化狀態,了解不同甲基化類型組成情況。

實驗結果
相比于其他植物高比例CG甲基化,蓖麻種子有較高比例的CHH甲基化狀態(達到68%)
相比于胚,胚乳表現出低CG和CHG甲基化,而CHH的甲基化水平幾乎不變
相比于胚,胚乳基因區的CG,CHG,CHH及TE區的CG,CHG都顯示低甲基化,唯獨TE區CHH顯示高甲基化

蓖麻種子CHH甲基化具有物種特異性
 


各物種胚和胚乳的甲基化組成分布比較
圖中縱坐標表示各種甲基化類型所占有比例,橫坐標表示各物種的胚和胚乳。其中em表示胚,En表示胚乳。

相對穩定的CHH甲基化

表中表示蓖麻種子胚和胚乳的CG,CHG,CHH三種甲基化水平比較,相比于胚,胚乳的CG及CHG明顯處于較低甲基化水平,但CHH的卻沒有明顯變化。

胚乳TE區高甲基化CHH


不同甲基化類型在胚和胚乳不同區域的分布狀態

图A从左到右依次表示CG,CHG, CHH在胚(红线)和胚乳(蓝线)的基因区域分布状态。
图B从左到右依次表示CG,CHG, CHH在胚(红线)和胚乳(蓝线)的TE区域分布状态。
其中,橫坐標表示基因或TE上下遊區域長度,縱坐標表示甲基化水平

3. 差异甲基化(DMRs)分析

實驗方法
通過胚和胚乳的甲基化基因位點相減之後,篩選(1.對于CG和CHG,胚和胚乳兩者間有>40%差異,其中一個甲基化水平不低于60%。2.對于CHH,有>20%差異性,其中一個甲基化水平不低于40%)出有效的DMRs。


實驗結果
發現20464個CG和25940個CHG的DMRs,其中99.9%在胚乳中都屬于低甲基化。同時發現2727個CHH的DMRs,其中只有55.9%在胚乳中表現出低甲基化。
相比于胚,胚乳的甲基化率更低(99.9%CG和CHG的DMRs,及55.9%CHH的DMRs),這與甲基化酶CMT和MET在胚的激活相關。

胚乳表現出低甲基化


表中表示各類型DMRs在胚和胚乳中的比較情況。

上表顯示,相比于胚,胚乳的總體甲基化率較低。但有趣的是,CHH在胚乳中的甲基化水平與胚相當。

4. DNA甲基化负调控基因表达

實驗方法
通過下載數據庫,找出胚和胚乳的差異表達基因;
將DMRs與差異表達基因進行位置關聯(比對到基因區域及基因上下遊2kb區域)分析,解釋DNA甲基化與基因表達的關系;
通過qPCR驗證結果。

實驗結果
低表達基因的上下遊及基因區域都有高甲基化的CHG和CHH,表示甲基化在一定程度上抑制胚的基因表達。
相比于胚,胚乳中高表达的基因都表现出5’, 基因区, 3’的CG和CHG低甲基化。这同样证明DNA甲基化与基因表达的负相关关系。
挑選28629.m000565和30093.m000370兩個在胚乳高甲基化的基因進行qPCR,發現其表達水平與甲基化水平呈負相關。

基因表達水平與甲基化水平呈負相關


圖B表示基因28629.m000565在胚乳及胚中的甲基化比較,圖C是基因在胚乳和胚的表達量比較
通過基因甲基化和表達量的關聯分析,明顯看出胚乳中DNA甲基化水平與基因表達量呈負相關關系

5. siRNA表达与DNA甲基化相关
實驗方法
对胚和胚乳进行small RNA测序
关联small RNA测序数据与BS数据,筛选24-nt siRNA,分析其与三种甲基化类型的位置及丰度相关性,从而解释siRNA与DNA甲基化的关系。

實驗結果
被24-nt siRNA覆盖的区域显示出高CHG和CHH甲基化,表示siRNA与DNA甲基化相关。
與胚相比,5個胚乳中參與RdDM的基因的低表達,證明RdDM與DNA甲基化有關。
胚乳中,基因區域以及TE區域的siRNA覆蓋度都與CHH的甲基化水平呈正相關,表示胚乳中高豐度的CHH與siRNA介導的RdDM有關。

siRNA介導RdDM調控CHH甲基化


圖示siRNA覆蓋度影響胚和胚乳的DNA甲基化水平
横坐标表示胚和胚乳中不同甲基化程度(高和低)的区域,纵坐标表示24-nt siRNA丰度

本文亮點

發現蓖麻特異性的胚乳高CHH與siRNA的關系
(有趣的線:1.胚乳有高豐度siRNA—2.胚乳TE的CHH高甲基化—3.抵消CMT在胚乳低活性—4.胚乳CHH甲基化狀態變化不大)


通过轉錄組測序,甲基化测序及small RNA测序的多组学分析,揭示蓖麻种子DNA甲基化负调控基因表达,以及siRNA可调控CHH甲基化状态。

分别3个生物学重复的胚和胚乳small RNA测序:分别提取胚及胚乳的total RNA,凝胶电泳后切除16-30nt的片段进行后续建库测序。去除rRNA,tRNA等原始数据,对clean data比对到蓖麻基因组中进行分析。

測序路線


 

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