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通過抑制EZH2恢複IKKa的表達促進了鼻咽癌細胞的分化

合作單位:中山大學附屬腫瘤醫院

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研究背景與目的:
95%的鼻咽癌(NPC)都是Ⅲ 型不分化恶性肿瘤,这为肿瘤诱导分化治疗提供了契机。目前肿瘤诱导分化治疗已经成功在多种恶性肿瘤,包括白血病、神经母细胞瘤中得到应用,但所涉及的具体分子机理还不清楚。因此,阐明鼻咽癌细胞不分化的分子机制,可以为寻找肿瘤诱导分化治疗的药物靶点提供潜在的理论依据。

實驗材料:
3對鼻咽癌組織(2T,3T,23T)和癌旁組織(2N,3N,23N),共6個樣本。

研究結果:
1. RNA-seq寻找候选基因——IKKα在不分化鼻咽癌组织中表达下调
對鼻咽癌組織和癌旁組織進行RNA-seq檢測,結果顯示,與癌旁組織相比,與上皮細胞分化相關的13個基因(包括IKKα)的表達量在三個NPC病人組織中都顯著下調。對包括IKKα在內的7個基因進行qPCR驗證,結果都與RNA-seq結果一致。

在這幾個經過驗證的候選基因中,爲什麽選擇IKKα來研究?原因有兩點:
1)前期研究表明,IKKα除了參與經典的NF-κB信號通路,還通過一種不依賴于NF-κB的途徑影響上皮細胞的分化;
2)在另外5對癌-癌旁組織中也檢測到IKKα表達下調,並且在正常鼻咽組織和高度分化的鼻咽癌細胞系(CNE1)中表達量很高,而在多個低分化的鼻咽癌細胞系(CNE2,SUNE1,HONE1)中低表達(圖1)。
因此,文章後續就圍繞IKKα這個基因,通過各種分子細胞實驗,來研究其中的分子機制。


图1 IKKα的表达量在另外5对癌-癌旁组织中下调(左);IKKα在多个低分化的鼻咽癌细胞系中低表达

2. 分子细胞实验验证IKKα功能——能够诱导细胞分化并减少细胞的肿瘤发生
在高度分化的鼻咽癌细胞系CNE1中利用siRNA技术沉默IKKα的表达,western blot实验显示,siRNA沉默IKKα显著减少了上皮细胞分化因子involucrin和CK8的表达,表明NPC细胞的不分化与IKKα表达下降有关(图2)。然后通过体外过表达实验和体内移植瘤实验,证明了IKKα能够诱导细胞分化并减少细胞的肿瘤发生(图3,图4),而且这并不依赖于NF-kB信号通路激活。


图2 siRNA沉默IKKα显著减少上皮细胞分化因子involucrin和CK8的表达


图3. 体外过表达实验证明IKKα能够诱导细胞分化并减少细胞的肿瘤发生


图4. 体内移植瘤实验证明IKKα能够减少细胞的肿瘤发生

 

3. 鼻咽癌细胞低分化的分子机制研究——IKKα被EZH2介导的启动子H3甲基化所抑制
分析發現,IKKα的啓動子區域含有一致性polycomb反應元件,猜測PRC2可能參與了IKKα的表達抑制。


polycomb蛋白家族
polycomb蛋白家族是一類進化上極爲保守的轉錄抑制因子,polycomb蛋白形成的polycomb抑制複合物(PRCs)通過表觀抑制的方式,在多種腫瘤中有著重要的作用。EZH2是PRC2複合物的一個具有催化活性的組成成分。

western blot结果显示EZH2和H3K27me3在低分化的鼻咽癌组织细胞中表达量大幅提高。然后通过CHIP、siRNA沉默EZH2、荧光素酶报告基因等实验,表明EZH2通过H3K27me3组蛋白甲基化来沉默IKKα的转录表达(图5)。


图5 western blot(b), CHIP实验(c),siRNA沉默实验(d),荧光素酶报告基因(f)结果

4. 诱导分化治疗药物验证
维甲酸(RA)是一种用于多种人类肿瘤诱导分化治疗的药物。为了检测促分化药物维甲酸在鼻炎癌中是否通过IKKα途径起作用,利用western blot、CHIP、荧光素酶报告基因、移植瘤等实验多方面验证,结果都发现维甲酸能够抑制EZH2的表达,使IKKα表达量升高,从而促进了肿瘤细胞的分化(图6)。


图6 维甲酸促进肿瘤细胞的分化

总  结:
1. 这是一篇非常典型的医学类文章,由于临床医学研究的最终目的是用于临床诊断和治疗,所以严谨性往往比其他的动植物基础研究要高得多。这篇文章综合运用了多种分子、细胞实验来验证,并且用真实的临床治疗药物来验证,论证严谨严密,而且临床意义较大。

2. 我们可以看到,RNA-seq在整个研究中的作用是前期筛选候选基因。RNA-seq或者其他的组学研究只是整个生物学问题研究的一部分,得到候选基因后,对候选基因的功能验证也是非常重要的。因此在设计实验的时候,要有从前到后的整体意识,才能让我们的研究更充分完整,发表的文章档次更高。

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