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泛素化介導花瓣衰老機制研究

 

合作老師:华南农业大学  余义勋
發表期刊:《Plant Physiology》     IF:6.28

文章下載鏈接:/uploads/tmp/genedenovo-resume-1492570663.8373396.pdf

植物花瓣生命周期短,因此是衰老研究的重要材料。衰老(凋謝)是一個非常複雜的過程,它在mRNA、蛋白以及翻譯後修飾等多個水平受到調控,其中蛋白質大量降解是衰老的重要標記。泛素化修飾是一種重要的蛋白質翻譯後修飾,它能夠促進蛋白質降解,因此泛素化被認爲與衰老有關。

另一方面,已有研究表明,乙烯能夠通過調節轉錄後修飾介導的蛋白降解參與到花瓣凋謝當中,但其機制還不明確。因此,本研究以矮牽牛花瓣爲材料,通過轉錄組、蛋白組和蛋白質泛素化修飾組學分析,研究乙烯對花瓣衰老過程的影響機制。


實驗取材
取16小时乙烯处理(实验组)和空气处理(对照组)各三个重复的花冠组织进行轉錄組測序、蛋白组以及泛素组质谱分析。

研究思路
文章主要通過蛋白組與泛素化組,輔助以轉錄組的方法開展研究(圖1)。


图1 文章研究思路

結果解讀
1、乙烯加速花瓣凋謝
在乙烯處理後16h,矮牽牛花冠裂片開始內卷,並且伴有透明小點出現,表明花瓣開始凋謝(圖2A)。在處理後32h,無論是花冠幹重(圖2B)還是蛋白含量(圖2C)都明顯降低。這些結果都表明乙烯加速了花瓣凋謝。


图2 乙烯对花冠影响
(A:上面爲乙烯處理組,下面爲未處理對照組;B、C:藍色爲對照組,紅色爲處理組)

2、乙烯引起花瓣轉錄、蛋白和泛素化組改變
由于花瓣衰老在mRNA、蛋白以及翻譯後修飾三個層面都有密切關系,因此作者分別通過轉錄組、蛋白組以及泛素化組同時研究乙烯對花瓣衰老的影響:

①首先,在转录组层面,利用根茎叶花等八个组织构建参考基因组后,通过轉錄組測序分析发现16小时的乙烯处理引起花瓣的14448个基因表达下调,6303个基因表达上调。qRT-PCR验证了其中的基因(图3),KEGG注释表明这些差异基因主要与植物激素信号转导等22条通路相关。

②然後,在蛋白水平,通過質譜分析發現了個3606個蛋白,其中上調的有233個、下調爲284個。GO注釋發現這些蛋白與雜環分解代謝過程等功能相關。

③最後,在翻譯後水平,也就是泛素化組(Ubiquitylome)進行研究。通過抗體富集以及質譜研究,精確地發現了2270個賴氨酸泛素化位點(Kub),其中乙烯處理後上調位點有320個,下調的則有127個。這些結果顯示乙烯處理增加了花冠泛素化水平。KEGG注釋表明這些正經曆泛素化的蛋白參與到剪接體、RNA轉運等多個通路當中(圖4)。


图3 转录组与qRT-PCR检测差异表达基因情况


圖4.具有差異Kub位點的蛋白功能注釋
(A:上調、B:下調)和KEGG注釋(C:上調、D:下調)

3、轉錄本數量與蛋白存在一定正相關性
以显著差异上、下调转录本为对象,对比对应的蛋白表达数据发现,上调转录本与对应蛋白存在一定相关性(r =0.49),而下调转录本则基本与蛋白数量难以产生联系(r=0.08)。同理,以显著上、下调蛋白为对象,对比对应转录本也发现上调部分有较高正相关(r=0.53),下调部分相关性较弱(r=0.21)。这可以预期到翻译后修饰有可能参与到蛋白调控当中,从而引起转录本与对应蛋白数量没有完全正相关。


图5 转录本与蛋白表达相关性
(A:所有差異轉錄本vs所有差異蛋白、B:上調轉錄本vs對應蛋白、C:下調轉錄本vs對應蛋白、D:上調蛋白vs對應轉錄本、E:下調蛋白vs對應轉錄本)

4、蛋白組與泛素化組存在負相關性
由于之前假设,乙烯处理能够引起泛素化的上调,从而导致蛋白的大量降解,因此下一步则研究花冠的蛋白组与泛素组之间的关系。通过蛋白组与泛素化组的关联分析,可以发现存在泛素化位点的蛋白共有1121个,其中985个正在经历泛素化作用。通过对蛋白质总体表达水平和泛素化修饰蛋白数量进行比较,发现无论整体(图4A)还是从上下调的蛋白(图4 B、C)以及泛素化蛋白(图4D、E)开始进行比较,蛋白组与泛素化组之间存在负相关性。表示泛素化与蛋白降解有关。


图6 总蛋白表达与泛素化位点蛋白相关性
(A:所有差異轉錄本vs所有具有泛素化位點差異蛋白(r=-0.38);B:上調蛋白vs對應泛素化位點(r=-0.51);C:下調蛋白vs對應泛素化位點(r=-0.4);D:上調位點vs對應蛋白(r=-0.32);E:下調位點vs對應蛋白(r=-0.25);F:整體統計)

5、泛素化參與乙烯引起的蛋白降解
數據不單證明蛋白與泛素化位點成負相關,而且進一步發現,乙烯處理能夠促進參與泛素化的蛋白的表達,從而引起蛋白大量降解。在轉錄組數據中,發現229個與泛素化相關的unigene在乙烯處理後發生上調。而蛋白組數據則發現4個蛋白在處理後發生上調。同時,在發生泛素化上調的蛋白當中,有44個的表達下調,只有8個上調。

这表明乙烯处理后,参与泛素化的基因和蛋白(如E3 ubiquitin-protein ligases)都大量表达,这些泛素化蛋白的表达最终引起其他蛋白产生泛素化,从而导致总体蛋白的大量降解。最后,KEGG分析发现,这些在蛋白和泛素化水平有相反趋势的蛋白主要参与到黄酮类物质合成、苯丙脂类代谢等通路当中。

6、乙烯通過多個途徑引起花瓣凋謝
最後,綜合轉錄組、蛋白組以及泛素化組的數據,作者詳細地對乙烯引起花瓣凋謝的多條通路進行詳細解釋。乙烯誘導了以下與衰老相關的通路改變:

①轉錄組和蛋白組數據都顯示,乙烯誘導了非泛素依賴降解酶的上升:如半胱氨酸降解酶、絲氨酸降解酶等。

②乙烯促進了與自噬作用相關蛋白的上調:如自噬蛋白PhATG8。

③乙烯處理影響植物激素合成和信號傳導途徑(圖7):乙烯處理後,SAM合成酶(乙烯生物合成的關鍵酶)的泛素化位點大量上升,引起蛋白的數肯陆担欢硪粋乙烯合成關鍵酶ACO由于去泛素化作用而出現上調。這些證據表明乙烯處理影響生物體內部的乙烯合成與其他激素的合成,如ABA、生長素等。

④最後,作者還發現了乙烯促進蔗糖合成和運輸、阻礙苯環類以及苯丙脂類揮發性物質的合成、減緩氨基酸合成等。這些發現都有助于了解乙烯如何影響花瓣生命周期。


图6 乙烯影响乙烯生物合成和信号传导示意图

文章小結
本文結合轉錄組、蛋白組與泛素化多個組學,在mRNA水平、蛋白水平以及翻譯後修飾水平深入研究花瓣的衰老機制。對大量衰老相關蛋白在衰老過程中泛素化修飾水平和蛋白質水平上的變化進行了重點分析,獲得了大量新的蛋白質泛素化修飾位點,從蛋白質泛素化修飾這一角度對花瓣衰老進行了新的诠釋。

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